Отримання амінокислот І білків




Скачати 422.8 Kb.
НазваОтримання амінокислот І білків
Сторінка1/3
Дата конвертації02.07.2013
Розмір422.8 Kb.
ТипДокументы
mir.zavantag.com > Культура > Документы
  1   2   3
Біотехнологія

  • Загальна біотехнологія:

  1. Клітинна інженерія.

  2. Генетична інженерія.

  • Спеціальна біотехнологія:

  1. Отримання антибіотиків.

  2. Отримання вакцин.

  3. Отримання гормонів.

  4. Іммобілізовані ферменти.

  5. Інтерферони.

  6. Отримання амінокислот і білків.

  7. Отримання вітамінів.

  8. Переробка відходів.


Клітинна інженерія

План

  1. Характеристика будови клітин. Клітинний цикл.

  2. Культури клітин.

  3. Гібридоми. Моноклональні антитіла.

  4. Клонування організмів.


Культури клітин

План

  1. Характеристика будови клітин. Клітинний цикл.

  2. Культури клітин.




  • Клітини прокаріот (бактерії та синьо-зелені водорості) не мають чітко оформленого ядра.

  • Клітини еукаріот (клітини рослин та тварин) мають ядро.

Будова клітини

  • Клітина оточена плазматичною мембраною, всередині є протоплазма яка включає ядро (зберігає генетичну інформацію) та цитоплазму. В цитоплазмі містяться органели: мітохондрії (забезпечують клітини енергією), рибосоми (синтез білка), лізосоми (містять гідролітичні ферменти), комплекс Гольджі (сітка розташована навколо ядра, тут проходить посттрансляційна модифікація білків), ендоплазматична сітка (розгалужена система каналів на яких проходять синтетичні процеси, виведення продуктів обміну, утворення органел), пероксисоми (містять ферменти, які розщеплюють Н2О2).

^ Клітинний цикл

  • Проміжок часу між закінчення поділу клітини і до початку нового поділу (мітотичний цикл).

  • Клітинний цикл поділяється на: 1) мітоз; 2) інтерфазу.

Інтерфаза поділяється на:

  • Пресинтетичний (постмітотичний) період G1 – триває від закінчення мітозу і до початку подвоєння ДНК. Клітина росте і в ній синтезуються РНК, ферменти, структурні білки, макроергічні сполуки, здійснюється транспорт глюкози та амінокислот в клітину.

  • Синтетичний період S – подвоюється ДНК, збільшується синтез гістонових білків.

  • Постсинтетичний (премітотичний) період G2 – нагромадження енергії та синтез сполук необхідних для здійснення поділу клітини.

Клітинний цикл для клітин HeLa становить 23 год:

G1 – 12 год,

S – 5 год,

G2 – 5 год,

М (мітоз) – 1 год

^ Тканинна культура

  1. Клітини можуть певний час жити поза організмом.

  2. Клітини можуть окремо жити і розмножуватись після міграції з фрагменту тканини в культуральне середовище.

Переваги клітинних культур над тканинними:

  1. Розмножуються.

  2. Можна заморозити і зберігати.

1955 рік
Ігл описав середовища Ігла до складу якого входять компоненти необхідні для існування клітин тварин в умовах in vitro

Культура клітин (клітинна культура) – культура роз’єднаних клітин, яка здатна більше 24 годин підтримувати життєдіяльність в умовах in vitro

^ Культури клітин отримують:

  1. Ембріональних тканин. Вони краще ростуть і виживають ніж культури з тканин дорослих організмів.

  2. Тканин дорослих організмів.

Культури клітин з нормальних тканин:

  1. Обмежений період життя.

  2. В умовах in vitro погано проліферують (окремі лінії нормальних клітин в умовах in vitro необмежено довго проліферують – MDCK з нирки собаки).

  3. Як правило не диференціюють, а якщо і диференціюють то припиняється проліферація.

Культур клітин з пухлин:

  1. В умовах in vitro необмежено проліферують.

  2. Здатні частково диференціювати із збереженням проліферації.

  3. Їх можна пасажувати на сингенних господарях для добування великої кількості (така популяція недостатньо гомогенна).

  4. Первинна культура клітин – культура, клітини якої взяті безпосередньо з організму (не піддавалась навіть одноразовому пасажуванню).

  5. Пасажована культура (субкультура) – культура клітин, яка хоча б один раз пересіяна (перенесена з однієї посудини в іншу).

  6. Клітинна лінія – культура клітин, яка виникає з первинної культури починаючи з першого пасажу.

  7. Постійна клітинна культура (лінія) – лінія, яка здатна витримати необмежену кількість пасажів (“безсмертна” клітинна культура).

  8. Клітинний штам – культура, клітини якої володіють характерними ознаками (маркерами) і виділені клітини за цими характерними ознаками (стійкість до вірусу, вироблення специфічного антигена, підвищена активність фермента).

Етапи отримання та культивування клітин:

  1. Отримання тканин.

  2. Дезагрегація тканин: а) осмотичний метод; б) ферментативний метод.

  3. Адгезія клітин до субстрату: а) клітини які можуть проліферувати в культуральному середовищі в суспензії не прикріпляючись до субстрату (деякі пухлинні клітини, клітини імунної системи, кісткового мозку та ін.); б) клітини які повинні бути прикріплені до субстрату (більшість нормальних клітин ссавців та ін.)

  4. Інкубація клітин: а) лаг-період (1-1,5 годин); б) стадія логарифмічного росту (4-5 діб); в) стадія плато (через 7 днів після висіву).

Середовища для інкубування клітин:

  1. Неорганічні солі які є: а) компоненти буферних систем, б) підтримують осмотичний тиск, в) макро- та мікроелементи.

  2. Індикатори для контролю рН.

  3. Амінокислоти, вітаміни, глюкоза живлення.

  4. Антибіотики – пригнічення росту мікрофлори.

  5. Сироватка крові: а) забезпечує клітини гормонами і гормоноподібними факторами росту, б) містить фактори необхідні для прикріплення клітин in vitro, в) має транспортні білки.

Синхронізація клітин у культурі:

  • Селективний метод (мітотичні клітини округлої форми і менші за розміром, тому при струшуванні легко відділяються від субстрату)

  • Індуктивні методи:

  1. Інгібітори (тимідин, аміноптерин та ін. блокують окремі життєво важливі метаболічні процеси)

  2. “Голодування” клітин (клітини які голодують зупиняться на стадії G1, інші загинуть).



Моноклональні антитіла

План

  1. Напрямки імунобіотехнології.

  2. Вимоги до пухлинних клітин.

  3. Методи гібридизації клітин.

  4. Селективне середовище ГАТ.

  5. Етапи отримання гібридом.

  6. Використання моноклональних антитіл.

Напрямки імунобіотехнології:

  1. Клонування лінії лімфоцітів в присутності факторів росту (інтерлейкінів).

Дія на Т-лімфоцити.

Нормальні лімфоцити, після активації мітогенами чи (і) антигенами, виробляють спеціальні імунофактори – лімфокіни, зокрема інтерлейкін-2.

Останні діючи на відповідні рецептори Т-лімфоцитів виділених з організму, стимулюють їх до багаторазової проліферації.

2. Трансформування лінії лімфоцитів вірусом Епштейна-Барр (ВЕБ).
Дія на В-лімфоцити.
ВЕБ, виділений з клітин африканської лімфоми, діє на В-лімфоцити, які трансформуються в лімфобластоїдні клітинні лінії.
Синтезовані цими клітинами препарати містять ВЕБ і тому їх не використовують для клініки а лише для діагностики.

3. Генетична інженерія імуноцитів.
Гени, що кодують продукцію антитіл, вводять в мієломні клітини. В результаті отримують химерні білки, окремі ділянки яких, після добудовування певних частин молекули є антитілами. (Від тварин можна отримати антитіла необхідні людині, або для іншого виду тварин).

4. Гібридоми

Тривало живучі культури гібридних клітин, що секретують антитіла визначеної специфічності

^ Суть методу:

Від імунізованої відповідним антигеном миші отримали лімфоцити, які “злили” із близькоспорідненою пухлинною клітиною. Отримані гібридоми синтезували і секретували специфічні антитіла, як перший з “батьків”, та необмежено ділились, як другий з батьків.

^ Вимоги до пухлинних клітин:

  1. При об’єднаннні їхніх хромосом з хромосомами нормальних лімфоцитів не повинен порушуватись біосинтез антитіл чи імунофакторів. (Для цього найкраще придатні “родичі” генетично (сингенні) та “родичі” того ж типу тканинної диференціації (для В-лімфоцитів це плазмацитоми, для Т-лімфоцитів це Т-лімфоми).

  2. “Легко” рости в культурі in vitro, щоб передати цю ознаку спадково гібридомам.

  3. “Легко” рости в черевній порожнині сингенних тварин, щоб отримати гібридомні асцити.

  4. Висока здатність до гібридизації (10-2 – із 100 клітин 1 утворює гібридому).

  5. Мутанти по визначених генах, що контролюють експресію життєво-необхідних ферментів.

Методи гібридизації клітин:

  1. Вірус Сендай – зараз не застосовують (біологічний).

  2. Лізолецитин або поліетиленгліколь (хімічний).

  3. Електричне або магнітне поле (фізичний).

У 2-3 рази ефективніше від хімічного методу. Процес можна контролювати під мікроскопом і відразу (без метаболічної селекції) відділяти гібридні клітини.

^ Відділення гідридом від батьківських клітин методом метаболічної селекції.
Середовище ГАТ (гіпоксантин-аміноптерин-тимідин).


  • Для синтезу ДНК та РНК необхідні пурини. Основна їх кількіть синтезується з амінокислот та вуглеводів de novo.

  • Лімфоцити мають ензим ГГФРТ (гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансфераза), який додатково обхідним шляхом забезпечує синтез пуринових нуклеотидів, що необхідні для синтезу ДНК та РНК.

  • Пухлинні клітини ГГФРТ не мають.

  • Компонент селективного середовища – аміноптерин блокує біосинтез пуринів (ГТФ, дГТФ, АТФ, дАТФ) та дТТФ de novo. Тому в такому середовищі, де ще буде гіпоксантин (субстрат для ГГФРТ) та тимідин (для синтезу дТТФ) виживуть лише лімфоцити та гібридні клітини, які успадкують від батьківських лімфоцитів цю властивість синтезу НК.

  • Лімфоцити, що не утворили гібридом, мають тривалість життя лише кілька днів.

  • Пухлинні клітини, що не у творили гібридом, в селективному середовищі загинуть.

  • Виживуть лише гібридоми.

  • Клітини мієломи і лімфоцити витримують від 1 до кількох хвилин у 40-50% розчині ПЕГ у фосфатному буфері.

  • Розбавлення 10 кратним об’ємом культурального середовища і осадження клітин.

  • Внесення клітин в чарунки де є: а) фідерні клітини (клітини перитонеального ексудату та клітини селезінки і тимусу – продукція в середовище факторів росту і фагоцитоз загиблих клітин; б) середовище ГАТ

  • Через 7-14 днів виростають колонії гібридних клітин. (“Юні” гібридні клітини здатні “губити” окремі хромосоми, тому контролюють рівень антитіл).

  • Через 3-4 тижні ГАТ замінюють на ГТ, а через кілька днів після цього на середовище без селективних добавок

  • Клонування гібридних клітин.

Етапи отримання моноклональних антитіл:

  1. Підбір або створення лінії пухлинних клітин.

  2. Імунізація тварин і отримання лімфоцитів.

  3. Підготовка культури фідерних клітин.

  4. Гібридизація клітин

  5. Селекція гібридних клітин.

  6. Тестування гібридом на продукцію антитіл.

  7. Клонування гібридом.

  8. Провірка антигенної специфічності гібридомних антитіл.

  9. Вирощування гібридом з мікрокультур у макрокультури.

  10. Паспортизація гібридом і моноклональних антитіл.

  11. Масове продукування гібридомних антитіл.

  12. Очищення гібридомних антитіл.

  13. Створення на основі отриманих моноклональних антитіл лікувальних чи діагностичних препаратів.

Використання моноклональних антитіл:

Онкологія

Ідентифікація пухлинних антигенів.

Діагностика та локалізація пухлин.

Лікування пухлин.

Пригнічення росту злоякісних пухлин.

Кардіологія

Локалізація некрозу міокарда.

Хірургія

Аналіз антигенів гістосумісності при трансплантації органів та тканин.

Локалізація тромбів та їх лізис.

Акушерство і гінекологія

Діагностика хвороб плода.

Діагностика вагітності.

Створення протизаплідних засобів.

Ендокринологія

Визначення гормонів (ФСГ, ЛГ, тиреотропін).

Гематологія

Визначення груп крові.

Резус-діагностика.

Аналіз системи згортання крові.

Фармакологія та хіміотерапія

Створення нових препаратів.

Створення протиотрут.

Створення імунотоксинів.

Очистка лікарських речовин.

Мікробіологія

Ідентифікація мікроорганізмів.

Отримання МАТ до токсинів.

Вірусологія

Ідентифікація вірусів: енцефаломієліту коней, папіломи худоби типу І, хвороби Ньокастла

Імунологія

Оцінка стану імунної системи.

Ідентифікація антигенів лімфоцитів.

Наук-дослід робота, харч. пром., рослинництво, геологія, палеонтологія

Клонування

κλών (грецьке) –гілка, пагін

  • Молекулярне клонування

  • Клонування клітин

  • Клонування організмів (терапевтичне і репродуктивне)

Терапевтичне клонування – отримання ембріональних стовбурових клітин, які в процесі росту можуть замінювати пошкоджені клітини дорослого організму. (Ембріон вирощують в умовах in vitro і вилучають з нього клітини обриваючи його життя). Хвороби Альцгеймера, Паркінсона, рак. (У листопад 2001 року вперше клоновано ембріон людини (Advanced Cell Technologies, Масачусетс, США).

^ Репродуктивне клонування – імплантація клонованого ембріона в самку, де він буде нормально розвиватись до народження.

ДНК з дорослої соматичної клітини вводиться в енуклейовану яйцеклітину (зливаються після короткої дії електричного струму.) Така ембріональна клітина починає рости і ділитись.

  • Пуголовок (Англія, 1952)

  • Риба: короп (Китай, 1963)

  • Вівця: ембріон.кл. (Шотландія, 1986); Megan та Morag, диф. ембріон. кл. (Шотландія, червень 1995); Dolly (Шотландія, 1996); Polly та Molly (Шотландія, липень 1997); Royana (Іран, 2006)

  • Миша: Маша, ембріон.кл. (СССР, 1986); Cumulina (США, 1997)

  • Мавпа: Tetra, самка (січень 2000)

  • Свиня: Millie, Christa, Alexis, Carrel, Dotcom (Шотландія, березень 2000); Xena, самка (серпень 2000)

  • Козел: Naoh, самець (січень 2001)

  • Худоба: Millie та Emma, самки (США, 2001); Alpha, самець (Бразилія, 2001); Beta, самець (Бразилія, 2005)

  • Кіт: CopyCat "CC", самка (2001); LittleNicky (2004) $

  • Кріль: (одночасно у Франції та Північній Кореї, квітень-травень 2003); гібрид людина-кріль (Китай, серпень 2003)

  • Мул: Idaho Gem, самець (4.05.2003); Utah Pioneer, самець (червень 2003); Idaho Star, самець (липень 2003)

  • Олень: Dewey (2003)

  • Кінь: Prometea, кобила (28.05.2003); Paris Texas, самець (трав. 2005)

  • Щур: Ralph, самець (2003)

  • Фруктова муха (2004)

  • Пес: афганська вівчарка Snuppy (Південна Корея, 2005)

Людина

  • Листопад 1998 – отримано гібрид від злиття соматичної клітини з ноги людини та енуклейованої яйцеклітини корови. Цю гібридну яйцеклітину не імплантували. На 12-му дні життя було перерване. Ембріон вважається персоною після 14-го дня.

  • Січень 2008 – отримано 5 зрілих людських ембріонів з використанням ДНК з соматичних клітин шкіри, які були ембріональними стовбуровими клітинами. Їх життя було перерване.

  1   2   3

Схожі:

Отримання амінокислот І білків iconЕлементи біоорганічної хімії
Відомо понад 150 амінокислот, добутих з природних джерел І методами органічного синтезу. Для біосинтезу білків організмів тварин...
Отримання амінокислот І білків iconТема: Сполуки із змішаними функціями
Мета: Вивчити властивості галогено-, гідроксі-, оксо-, амінокислот І білків. Добути оцтовоетиловий естер, використовуючи 10 мл етилового...
Отримання амінокислот І білків icon1. Співвідношення білків, жирів І вуг-леводів у молоці жінки таке
Дитина віком 3 місяці знаходиться на штучному вигодовуванні. У дитини алергія до білків коров'ячого молока при відсутності перехресної...
Отримання амінокислот І білків iconОбмін білків Заняття №1 (методичка №9)
Відсутність у шлунковому соці вільної соляної кислоти при наявності пепсину носить назву
Отримання амінокислот І білків iconПредмет І задачі біохімії. біомолекули та клітинні структури. Методи...
Модуль 2: Загальні закономірності метаболізму. Метаболізм вуглеводів, ліпідів, амінокислот та його регуляція
Отримання амінокислот І білків iconЛабораторна робота №7 порівняльна характеристика отримання заготовки...
Вивчення методики економічної оцінки способів виробництва заготовок на прикладі порівняння отримання однієї І тієї ж кованки штампуванням...
Отримання амінокислот І білків iconКонкурс на отримання стипендій на навчання у внз литовської Республіки
Міністерство освіти І науки Литовської Республіки оголосило конкурс на отримання стипендій на навчання у вищих навчальних закладах...
Отримання амінокислот І білків iconНутріціологічна І дієтологічна характеристики молока І молочних продуктів
Джерело білків, не­замінних аміно­кислот, добре засво­юваного кальцію, ростових та ліпо-тропних речовин, лактози, вітамінів А, D,...
Отримання амінокислот І білків iconСитуаційні задачі до Модуля 1 з «Гігієни та екології» для студентів...
Розрахувати кількість білків, жирів І вуглеводів, що міститься у добовому раціоні дітей та дати гігієнічну оцінку
Отримання амінокислот І білків icon№ Правові засади спілкування з органами влади з питань отримання...
Тема № Правові засади спілкування з органами влади з питань отримання дозволів в сфері господарської діяльності
Додайте кнопку на своєму сайті:
Школьные материалы


База даних захищена авторським правом © 2013
звернутися до адміністрації
mir.zavantag.com
Головна сторінка